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大腸桿菌蛋白表達感受態(tài)細胞的制備

更新時間：2023-10-07

閱讀：538

大腸桿菌蛋白表達系統是目前應用*泛，也是實惠的蛋白表達系統。E. coli具有遺傳背景清楚、細胞增殖快、表達量高、穩(wěn)定性好和抗污染能力強等特點，適用于多種屬蛋白的表達。本文主要講述了大腸桿菌蛋白表達實驗中感受態(tài)細胞制備實驗流程和原理。

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01
感受態(tài)細胞的概念

COMPETENT
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感受態(tài)，是指宿主細胞最容易接受外源基因并實現將其轉化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡以及外界環(huán)境因子的影響， 比如Ca2+就可以大大促進轉化的作用。細胞的感受態(tài)一般出現在對數生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉化的關鍵。

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02
感受態(tài)細胞制備的原理

制備感受態(tài)細胞的方法是用預冷的CaCl2處理對數生長期的細菌，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時處理快速生長（進入對數生長期）的細菌，從而獲得感受態(tài)細胞。此時細胞膨脹成球形，外源DNA分子在低溫條件下易形成抗DNA酶的羥基－鈣磷酸復合物粘附在細胞表面，通過熱激處理促進細胞對外源DNA分子的吸收。轉化效率非常高。此方法的關鍵在于選用的細胞必須處于對數生長期，實驗操作必須在低溫無菌環(huán)境下進行。



03
大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗


01
實驗儀器及試劑

  • 儀器：超凈工作臺，搖床，高壓滅菌鍋，培養(yǎng)箱，制冰機，超低溫冰箱，離心機，接種環(huán)，試管，搖瓶（2L），平板，移液槍，槍頭，離心管(500mL),EP管(1.5mL),藍蓋瓶，泡沫箱

  • 試劑：CaCl2溶液：PIPES 1.51g，CaCl2•2H2O 4.41g，甘油 75ml，pH=7.0，定容至500ml。

LB培養(yǎng)基（固體、液體）：Tryptone 1.00g，Yeast 0.50g，NaCl 1.00g，定容至100ml。（固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂）

抗性：卡那霉素，氨卞青霉素，氯霉素，四環(huán)素。

  • 材料：感受態(tài)菌株


02
實驗方法及操作步驟
  • ?。?0℃凍存的感受態(tài)菌株，用接種環(huán)劃線分離接種于固體平板上（平板抗性根據感受態(tài)選擇），做好標記，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
  • 第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有4ml LB培養(yǎng)液（抗性根據感受態(tài)選擇）的試管中，37℃,195rpm，震蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液4ml接種至含有400ml LB培養(yǎng)基（抗性根據感受態(tài)選擇）的2L搖瓶中，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)約2-3小時。
  • 當菌落OD600nm值達到0.3－0.5時，將搖瓶取出放置于冰上10-15min。在無菌條件下把菌液倒入500ml的預冷的離心管中，離心4℃,3000r，8min。
  • 棄去上清，加入約200ml的預冷的CaCl2溶液，吹打混勻，懸浮菌體，放入冰浴30min。
  • 離心4℃,3000r，8min，棄去上清，加入約8ml預冷的CaCl2溶液，重新懸浮菌體。
  • 將用CaCl2溶液處理后的菌體分裝于1.5ml的EP管中，每管110ul，保存于-80℃的超低溫冰箱中。



04
感受態(tài)細胞測試

隨機取1支本次制備的感受態(tài)細胞，轉化一個以前轉化成功的質粒，從轉化平板上的菌落數及表達鑒定的SDS-PAGE電泳圖(看是否出現其他的雜帶及蛋白表達情況)判斷感受態(tài)的效價。如果效價好，這批感受可以用；否則，要重新制備。


注意事項

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1、每次取感受態(tài)細胞時，注意查看庫存，保證庫存不低于15支，少于15支時要及時制備。
1、菌株生長在對數時進行CaCl2處理。
2、全程操作要【低溫無菌】。
3、用CaCl2溶液懸浮菌體時要均勻，不要有塊狀。
4、常用感受態(tài)細胞的選擇抗性：BL21（DE3）無抗性；BL21 Codon plus（DE3）具有氯霉素抗性；OrigamiB（DE3）具有卡那霉素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性質粒的表達；BL21（DE3）plysS具有氯霉素抗性；Rosetta（DE3）具有氯霉素抗性；Shuffle具有鏈霉素抗性或不用抗性。